Barbara O’Neil was een tijd aangesloten bij de University Players, een groep van acteurs en actrices die in Cape Cod tijdens de zomer toneelvoorstellingen gaven. Voor een aantal onder hen was dit een belangrijke fase in het verder uitbouwen van een succesvolle carrière: James Stewart, Margaret Sullavan, Henry Fonda en Myron McCormick maakten net als O’Neill deel uit van het gezelschap
Barbara O’Neill is het product van een sociaal prominente familie van New England, ze was voor het eerst te zien op Broadway in 1930, haar Hollywood-carrière ging van start in 1937. Haar rol als de moeder van Scarlett O’Hara in Gone With the Wind (1939) is memorabel.
Opvallend is dat Barbara O'Neill veel te zien was in de rol van gekke vrouw en andere neurotische personages.

Barbara O’Neill trouwde met toneelschrijver/regisseur Joshua Logan maar hun huwelijk hield niet lang stand.